ISSN 1301-143X | E-ISSN 1309-1484
Özgün Araştırma
blaOXA-48’in Saptanması İçin İzotermal Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyon Tekniği ve “Lateral Flow” Saptama Yöntemine Dayalı Hızlı Moleküler Bir Test Formatının Geliştirilmesi
1 İstanbul Üniversitesi, Cerrahpaşa Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İstanbul, Türkiye  
Klimik Dergisi ; : -
DOI: 10.5152/kd.2018.46
Anahtar Kelimeler: blaOXA-48, izotermal amplifikasyon, rekombinaz polimeraz amplifikasyon, lateral flow.
Özet

 

Amaç: Karbapenem direnci son yıllarda dünya genelinde hastanelerde önemli bir mortalite ve morbidite nedeni olmasıyla ciddi bir tehlike oluşturmaktadır. blaOXA-48 ilk kez 2004 yılında Türkiye’de tanımlandı ve günümüzde karbapenem direncinden sorumlu başlıca mekanizmalardan biri haline gelmiştir. Karbapenemazları kodlayan genlerin saptanmasında moleküler testlerin hızlı, güvenilir ve çeşitli seçeneklerinin bulunmasına karşın; maliyet, iyi eğitimli teknisyen ihtiyacı ve cihaz gereksinimleri bu testlerin yaygın kullanımını kısıtlamaktadır. Bu sorunları aşabilmek için son yıllarda yeni bazı izotermal amplifikasyon yöntemleri geliştirilmiştir. Bu tarz yöntemlerden biri olan rekombinaz polimeraz amplifikasyon (RPA) yöntemi hedefin denatürasyonunu gerektirmez ve prob tabanlı saptama yöntemleriyle RPA ürünleri özgün bir cihaz olmadan bile saptanabilmektedir. Bu çalışmada RPA tabanlı izotermal amplifikasyon yöntemiyle “lateral flow” sistemi birleştirilerek blaOXA-48’i saptayacak hızlı ve sahada kolay uygulanabilir bir test formatının geliştirilmesi amaçlandı.

 

Yöntemler: Bu çalışmada hastanemiz hastane infeksiyon kontrol komitesine ait karbapeneme dirençli ve duyarlı koleksiyon kökenleri (24 blaOXA-48-pozitif köken, birer adet blaVIM-, blaIMP-, blaNDM-, blaKPC-pozitif köken ve 10 adet karbapeneme duyarlı blaOXA-48-negatif köken) çalışmaya dahil edildi. Kökenlerin Müller-Hinton agarda 24 saatlik kültürleri hazırlandıktan sonra 1xPCR tamponunda yoğunlukları 0.5 McFarland olacak şekilde süspansiyonları hazırlandı. Testin performansının ve alt saptama sınırının belirlenmesi için blaOXA-48-pozitif kökenden de ayrıca dilüsyonlar hazırlandı. Bu örneklerden kaynatma yöntemiyle nükleik asid izolasyonu yapıldı. Örnekler tasarlanan blaOXA-48 RPA primerleri ve nfo probuyla RPA yöntemi kullanılarak üretici talimatları doğrultusunda amplifiye edildi. RPA ürünlerinin saptanması için “lateral flow” yöntemi kullanıldı.

 

Bulgular: blaOXA-48 enzimi kodlayan bütün kökenler yaklaşık 45 dakika gibi kısa bir sürede hiçbir özel cihaza gerek duymadan saptanabildi. Saptama alt limiti 10 bakteri olarak belirlendi. Karbapenem direncine neden olan diğer enzimleri kodlayan kökenlerde ya da blaOXA-48 kodlamayan kökenlerde pozitif sinyal saptanmadı.

 

Sonuçlar: Basit uygulanabilirliği ve taşınabilir olması dolayısıyla geliştirilen test formatı gerek laboratuvar gerek saha uygulamalarında diğer moleküler testler (polimeraz zincir reaksiyonu [PCR], “real-time” PCR gibi) için bir alternatif olabilecektir.

 

Cite this article as: Kuşkucu MA, Aygün G, Karakullukçu A, İmamova N, Küçükbasmacı Ö, Midilli K. [Development of a rapid molecular test format based on isothermal recombinase polymerase amplification technique and lateral flow detection method for detection of blaOXA-48]. Klimik Derg. 2018; DOI: 10.5152/kd.2018.46

Anahtar Kelime
Yazarlar
Tümü
Hakem Köşesi
Yazar Köşesi
Sık Sorulan Sorular
Anket
AVES | Copyright © 2018 Türk Klinik Mikrobiyoloji ve İnfeksiyon Hastalıkları Derneği| Son Güncelleme: 28.12.2018