Özet

Amaç: Çalışmamızda TR201804452A2 patent başvuru numaralı nanopartikül lipozom molekülü kullanılmış ve Staphylococcus aureus (ATCC 25923) ve Escherichia coli (ATCC 25922) suşları için Minimum İnhibitör Konsantrasyonu (MİK) 1562 ppm olarak bulunmuştur. ASTM F 1980 standardına göre, bir yıllık stabilite karşılığı olarak 37 gün ve 55 ^oC’de bekletilmiş nanopartikül lipozom solüsyonunun etkinliğini koruduğu tespit edilmiştir. Çalışmamızla hedeflenen, yeni geliştirilen solüsyonun uzun süre etkinliğini koruduğunu göstermektir.

Yöntemler: Standard ozonlama mekanizmalarından farklı bir teknikle geliştirilmiş olan nanopartikül lipozom solüsyonunun, CLSI M07-A10 (Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically. Tenth ed. Approved Standard) standard test yöntemi temas süresi modifiye edilerek antibakteriyel testleri yapılmış ve solüsyonun MİK değeri ve zamana bağlı etkisi belirlenmiştir. Nanopartikül lipozom solüsyonunun kararlılık testi için ise ASTM F 1980 standardına göre, bir yıllık stabilite karşılığı olarak 37 gün ve 55 ^oC’de bekletilmiştir.

Bulgular: Nanopartiküler ozon solüsyonunun MİK’i, CLSI M07-A10 standard test yöntemi temas süresi modifiye edilerek, S. aureus (ATCC 25923) ve E. coli (ATCC 25922) suşları için 1.562 ppm olarak saptanmıştır. S. aureus (ATCC 25923) için 1. saatin sonunda 2000 ve 1750 ppm nanopartikül lipozom solüsyonu konsantrasyonunda etkinliğin başladığını, E. coli (ATCC 25922) suşu için ise 2000 ppm nanopartiküler ozon solüsyonu konsantrasyonunda 10. dakikada etkinliğin başladığı saptanmıştır. Solüsyon etkinlik açısından ASTM F 1980 standardına göre bir yılın sonunda halen etkin olarak bulunmuştur.

Sonuçlar: Sonuç olarak, yeni bir ürün olan nanopartikül lipozom solüsyonu, bilinenin aksine uzun süre kararlılığını ve etkinliğini kaybetmemektedir. Gaz ozonun yarılanma ömrü 20 dakika gibi kısa bir süre olmasına rağmen, nanopartikül lipozom solüsyonunda stabilite en az 1 yıl olarak belirlenmiştir. Nanopartikül lipozom solüsyonu, doğal ve yavaş salınımlı bir ürün olduğu için, uygun dozlarda hazırlanacak solüsyonlarla burun, boğaz, göz ve kulak gibi bölgelerdeki mukozal membranlarda bir bariyer oluşturabileceği, bu sayede de bakteri yerleşmesini engelleyebileceği düşünülmektedir.

GİRİŞ

Ozon, bakteriler, mantarlar ve virusler için antimikrobiyal özellikli bir ajandır. Bu etkisini mikroorganizmaların organellerini etkileyerek, hücre duvar yapısını bozarak ya da protein sentezini durdurarak gösterir. Yıllardır ozon ile yapılan pek çok araştırma göstermiştir ki, bakterisidal, fungisidal, virusidal ve antiparazitik etkisi nedeniyle, bu tür mikroorganizmalardan kaynaklanan infeksiyonların ve eşlik eden inflamasyon ve ağrı gibi semptomların tedavisinde etkin rol oynamaktadır (1-2).

Ozon gaz haldeyken kararlı bir ürün değildir ve uygulamalarında özel makine gerektirdiği için yaygın ve pratik kullanım imkanı bulunmamaktadır. Bu nedenle, ozonu stabilize etmek ve onun antiviral ve antibakteriyel etkilerinden yararlanmak için ozon çözeltileri hazırlanmıştır. Ozonun bitkisel yağlar ya da emülgatörlerle kullanılması, ürünün yavaş salınımlı ve nanopartikül yapısında olmasını da sağlamıştır. Criegee tarafından 1975’te önerilen, çift bağların oksidatif bölünmesini içeren mekanizma, yaygın olarak etkinliği gösteren mekanizma kabul edilmiştir (3).

Literatürde ozonun bitkisel yağlarda stabil olduğu ve yıllarca aynı dozlarda kalabileceği belirtilmiştir (4). Dolayısıyla ozonlanmış yağlar uzun yıllardır kozmetik sektöründe ya da yara tedavileri gibi amaçlarla etkin ve güvenilir şekilde kullanılabilmiştir (5). Benzer bir ozonlama tekniği ile geliştirmiş olduğumuz nanopartikül lipozom solüsyonunun, standard stabilite ve sterilite testlerini yaparak bir yıl süreyle antibakteriyel etkinliğini sürdürdüğünü gösterdik.

YÖNTEMLER

Antimikrobiyal Solüsyonun Hazırlanması

Çalışmamızda bitkisel yağın ozonlanma miktarı mg cinsinden, bitkisel yağdaki ozon gazı ağırlığı ise mg/gr olarak hesaplanmıştır. Literatürde kabul edilen önceki ozon yağı ürünlerinde sadece ozon yağındaki ozon miktarı verilebilmişken, bizim ürünümüzde hem yağın ozonlama miktarı hem de ozon gazı ağırlığı verilebilmiştir. Dolayısıyla solüsyonu elde ederken bitkisel yağ oranı düşürülür ve ozon oranı arttırılırsa daha aktif nanopartikül lipozom solüsyonu; bitkisel yağ oranı arttırılır ve ozon oranı azaltılırsa daha yavaş salınımlı bir solüsyon elde edilebilme avantajı sağlanmıştır.

Çalışmamızda, ozonlanmış tıbbi bitkisel yağ ve %0,9 NaCl içeren hacim olarak litreye ayarlanmış distile suyun yüksek devirde ultrasonik kavitasyonu ve soğuk spreyleme tekniği ile homojenize nanopartikül lipozom solüsyonunu elde edilmiştir. Solüsyonumuz mg/l olarak kabul ettiğimiz değerde ozon içermektedir ve bu oran ppm değerini göstermektedir. Nanopartikül lipozom solüsyonu için TR201804452A2 numaralı patent başvurusu da yapılmıştır.

Nanopartikül Lipozom Solüsyonunun Antibakteriyel Etkinliği

Mikroorganizmalar antimikrobiyal ürünlere karşı çok farklı şekilde duyarlılık gösterirler. Bu durum, hem antibakteriyel ürünün yapısına ve hem de mikroorganizmaların türüne göre değişebilir. Bu nedenle koruyucu amaçla ve daha da önemlisi sağaltım için kullanılacak antimikrobial ürünlerin spesifik hastalık etkenine karşı olan statik ve/veya sidal etkisinin çok iyi belirlenmesi ve böyle bir ürünün seçilerek, bir program dahilinde yeterli sürede ve dozda kullanılması gereklidir.

Nanopartikül Ozon Solüsyonunun Minimal İnhibitör Konsantrasyonunun (MİK) Belirlenmesi

Çalışmamızda, CLSI M07-A10 (Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically. Tenth ed. Approved Standard) standard test yöntemi temas süresi modifiye edilerek antibakteriyel testler yapılmış ve nanopartikül ozon solüsyonunun MİK, Staphylococcus aureus (ATCC 25923) ve Escherichia coli (ATCC 25922) bakterileri kullanılarak belirlenmiştir. Klinik ve Laboratuvar Standardları Enstitüsü (Clinical and Laboratory Standards Institute – CLSI)’nün önerileri doğrultusunda, 24 saatlik bakteri kültür kolonilerinden 0,5 McFarland bulanıklığa eşit olacak şekilde bakteri süspansiyonu hazırlanıp, son konsantrasyonu 3×10⁶ koloni oluşturan birim (cfu)/ml olacak şekilde U tabanlı tüplere konulmuştur. 50 000 ppm ozon içeren stok bir çözelti hazırlanıp, son ozon konsantrasyonları 50 000 ppm – 25 000 ppm – 12 500 ppm – 6250 ppm – 3125 ppm- 1562 ppm – 780 ppm – 390 ppm – 195 ppm – 97 ppm olacak şekilde tüpler ayarlanmıştır. Bir saat sonra tüplerden standard öze kullanılarak alınan örnekler kanlı agar besiyerine (Germany – Becton Dickinson) ekilmiş ve 37ºC’ de 24 saat inkübasyon sonrasında yapılan değerlendirmede gözle üreme görülmeyen en düşük nanopartikül ozon solüsyonunun konsantrasyonu MİK olarak kabul edilmiştir. Çalışmada pozitif kontrol için E. coli (ATCC 25922) süspansiyonu ve negatif kontrol için de bakteri süspansiyonu içermeyen nanopartikül lipozom solüsyonu kullanılmıştır.

Nanopartikül Ozon Solüsyonunun Zamana Bağlı Etkisinin Belirlenmesi

Minimal inhibitör konsantrasyon değeri belirlendikten sonra, MİK altı ve üzerine yakın konsantrasyonlarda hazırlanmış nanopartikül ozon solüsyonunun üzerine 0.5 McFarland’a ayarlanmış S. aureus (ATCC 25923) ve E. coli (ATCC 25922) süspansiyonları eklenerek, son konsantrasyonları 2000 ppm -1750 ppm – 1500 ppm-1250 ppm -1000 ppm -750 ppm – 500 ppm olacak şekilde tüpler ayarlanmıştır. Bu karışımlardan 2.dk-10.dk-30.dk-1. saat-2. saat-3. saat- 4.saat – 5.saat-6.saatte örnek alınmış, alınan örneklerin kanlı agar besiyerine (Germany- Becton Dickinson) ekimleri yapılarak 37ºC’ de inkübe edilmiştir. 24 saatlik inkübasyonun ardından plaklar üreme açısından incelenmiş ve üremenin olmadığı plaklar, üremenin inhibisyonunun gerçekleştiği değer olarak kayıt altına alınmıştır.

Nanopartikül Ozon Solüsyonunun Kararlılık Testi

Standard kararlılık testi için, yapılan testlerin sonucunda etkinliğin saptandığı konsantrasyonda ozon solüsyonu hazırlanarak ASTM F 1980 standardına göre, bir yıllık stabilite karşılığı olarak 37 gün ve 55 ^oC’ de bekletilmiştir. Bu sürenin sonunda, nanopartikül ozon solüsyonu yine 0.5 McFarland’a ayarlanmış S. aureus (ATCC 25923) ve E. coli (ATCC 25922) suşlarının süspansiyonları eklenerek, 2.dk-10.dk-30.dk-1.saat-2.saat-3.saat-4.saat-5.saat-6.saat bekleme sürelerinin sonunda örnek alınarak, kanlı agar besiyerlerine (Germany- Becton Dickinson) ekim yapılmış, 24 saatlik 37 ºC’de inkübasyona bırakılmış ve sürenin sonunda üreme olup olmadığı değerlendirilmiştir. Daha önceden etkinliğin saptandığı konsantrasyonda ve belirlenen temas süresinde solüsyonun etkin olması kararlılık olarak yorumlanmıştır.

BULGULAR

Tablo 1.CLSI M07-A10 Yöntemine Göre Staphylococcus aureus (ATCC25923) ve Escherichia coli (ATCC25922)’a Karşı 1 Saat Temas Süresi Sonrası MİK Değerleri

Tablo 2.Staphylococcus aureus (ATCC 25923) ve Escherichia coli (ATCC 25922) Bakterilerinin, Farklı Ppm Düzeylerindeki ve Farklı Sürelerdeki Testleri

Tablo 3.Nanopartikül Lipozom Solüsyonu* Kararlılık Test Sonuçları

Nanopartiküler ozon solüsyonunun MİK’i, CLSI M07-A10 standard test yöntemi temas süresi modifiye edilerek S. aureus (ATCC 25923) ve E. coli (ATCC 25922) suşları için 1.562 ppm olarak saptanmış ve değerlendirme Tablo 1’de sunulmuştur.

Nanopartikül ozon solüsyonunun zamana bağlı etkisinin belirlenmesi için yapılan çalışmada, S. aureus (ATCC 25923) ve E. coli (ATCC 25922) suşlarının, nanopartikül lipozom solüsyonunun farklı ppm düzeylerinde ve farklı sürelerdeki etkinliği ile ilgili veriler Tablo 2’ de sunulmuştur. Test sonucunda S. aureus (ATCC 25923) için 1. saatin sonunda 2000 ve 1750 ppm nanopartikül lipozom solüsyonu konsantrasyonunda etkinliğin başladığı, test edilen tüm konsantrasyonlarda ise nanopartikül lipozom solüsyonunun 2. saatten itibaren etkin olduğu saptanmıştır. E. coli (ATCC 25922) suşu için ise, 2000 ppm nanopartiküler ozon solüsyonu konsantrasyonunda 10. dakikada; 1750, 1500 ve 1250 ppm nanopartikül ozon solüsyonu konsantrasyonunda 30. dakikada; 500 ppm nanopartikül ozon solüsyonu konsantrasyonu dışındaki diğer konsantrasyonlarda 1. saatin sonunda ve 500 ppm konsantrasyonda ise 2. saatin sonunda etkinliğin başladığı saptanmıştır.

Yapılan testlerin sonucunda 1000 ppm düzeylerinde bile nanopartikül lipozom solüsyonunun oldukça etkin olduğu gözlenmiştir. Bu nedenle kararlılık testi için 1000 ppm konsantrasyonda nanopartikül lipozom solüsyonu test edilmiştir. Test edilen solüsyon 37 gün ve 55 ^oC’ de bekletilerek bir yıla karşılık gelen standard kararlılık testi uygulanmıştır. 37 günün sonunda nanopartikül ozon solüsyonunun, S. aureus (ATCC 25923) ve E. coli (ATCC 25922) suşlarına 2. dk-10. dk.-30. dk-1. saat-2. saat-3. saat-4. saat-5. saat-6. saat temas süreleri sonunda saptanan etkinliği Tablo 3’de sunulmuştur. Elde edilen veriler taze nanopartikül lipozom solüsyonu verileri ile uyumludur ve solüsyon etkinlik açısından ASTM F 1980 standardına göre bir yılın sonunda halen etkin olarak bulunmuştur.

İRDELEME

Çalışmamızda, belirlenen MİK değerinin altındaki konsantrasyonlarla zamana bağlı öldürme etkisi yönünden ürün incelendiğinde, MİK değerinin altındaki ppm düzeylerinde de ürünün antibakteriyel etkinlik gösterdiği görülmüştür.

Sonuç olarak, yeni bir ürün olan nanopartikül lipozom solüsyonu, bilinenin aksine uzun süre kararlılığını ve etkinliğini kaybetmemektedir. Ozon gazı kararsız bir molekül olmasına rağmen, tıbbi bitkisel yağlara özel tekniklerle bağlandığında kararlı bir yapı oluşturduğu gösterilmiştir. Gaz ozonun yarılanma ömrü 20 dakika gibi kısa bir süre olmasına rağmen, nanopartikül lipozom solüsyonunda stabilite en az 1 yıl olarak belirlenmiştir. Uzun süre etkinliğini devam ettirdiği için nanopartikül lipozomların farklı dezenfaktanların eldesinde ya da ilaç sektöründe belirli alanlarda kullanılabileceği düşünülmektedir. Ozonun antibakteriyel özelliği nedeniyle nanopartikül lipozom solüsyonunun yüzey dezenfektanı olarak da kullanılması mümkündür. Nanopartikül lipozom solüsyonu, doğal ve yavaş salınımlı bir ürün olduğu için, uygun dozlarda hazırlanacak solüsyonlarla burun, boğaz, göz ve kulak gibi bölgelerdeki mukozal membranlarda bir bariyer oluşturabileceği, bu sayede de bakteri yerleşmesini engelleyebileceği düşünülmektedir (8). Öte yandan pek çok antibakteriyel ürünün toksik etkisine karşın, nanopartikül lipozomların toksik bir etkisinin olmaması yine önemli bir avantaj sağlayacaktır. Ürünün toksik etkiye yol açmadığı, Çukurova Üniversitesi Adana Genetik Hastalıklar Tanı ve Tedavi Merkezi (AGENTEM) tarafından 06.11.2020 tarih ve AGTM-17 sayılı test raporu ile gösterilmiştir. Nanopartikül lipozomların farklı kombinasyonları ile araştırmalarımız sürdürülmektedir.

Danışman Değerlendirmesi
Bağımsız dış danışman.

Yazar Katkıları
Fikir/Kavram – P.E.A., C.Ö., M.E.G.; Tasarım – P.E.A., C.Ö.; Denetleme – ; Kaynak ve Fon Sağlama – P.E.A., C.Ö., M.E.G.; Malzemeler/Hastalar – .E.A., C.Ö.; Veri Toplama ve/veya İşleme- .E.A., C.Ö., M.E.G.; Analiz ve/veya Yorum – .E.A., C.Ö., M.E.G., A.Ü.S.; Literatür Taraması – P.E.A., C.Ö.; Makale Yazımı – P.E.A.; Eleştirel İnceleme- C.Ö., P.E.A., A.Ü.S.; Diğer – .

Çıkar Çatışması
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması bildirmemiştir.

Finansal Destek
Yazarlar finansal destek beyan etmemişlerdir.

Referansları Görüntüle

Referanslar

Fernandez-Cuadros ME, Perez-Moro OS, Albaladejo-Florin MJ. Ozone fundamentals and effectiveness in knee pain: Chondromalacia and knee osteoarthritis. Middle East J Rehabil Health. 2017 January; 4(1):e41821.
Fernández-Cuadros ME, Pérez-Moro OS, Albaladejo-Florin MJ, Álava S. El ozono intrarticular modula la inflamación, mejora el dolor, la rigidez, la función y tiene un efecto anabólico sobre la artrosis de rodilla: estudio cuasiexperimental prospectivo tipo antes-después, 115 pacientes. Rev. Soc. Esp. Dolor. 2020; 27(2): 78-88. [CrossRef]
Criegee R. Mechanism of ozonolysis. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1975;14:745–752. [CrossRef]
Cirlini M, Caligiani A, Palla G, De Ascentiis A, Tortini P. Stability studies of ozonized
sunflower oil and enriched cosmetics with a dedicated peroxide value determination. Ozone: Science & Engineering: The Journal of the International Ozone Association, 2012; 34:4, 293-299. [CrossRef]
Guerra BP, Poznyak T, Pérez A, Gómez YM, Bautista RME, Chairez I. Ozonation Degree of Vegetable Oils as the Factor of Their Anti-Inflammatory and Wound-Healing Effectiveness, Ozone: Science & Engineering, 2017; 39:5, 374-384. [CrossRef]
CLSI. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard – Tenth Edition. CLSI document M07-A10. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2015.
ASTM F1980-07(2011), Standard Guide for Accelerated Aging of Sterile Barrier Systems for Medical Devices, ASTM International, West Conshohocken, PA, 2011, www.astm.org
Alkan PE, Güneş ME, Özakın C, Sabancı AÜ. New Antibacterial Agent: Nanobubble Ozone Stored in Liposomes: The Antibacterial Activity of Nanobubble Ozone in Liposomes and Their Thymol Solutions, Ozone: Science & Engineering, 2021. [CrossRef]

En Çok Okunanlar

Cilt 34, Sayı 2

Nanopartikül Lipozomlar: Bakteriyel İnfeksiyonlar İçin Yeni Bir Strateji Olabilir mi?