GİRİŞ

Helicobacter pylori (H. pylori), ilk kez 1983 yılında Warren ve Marshall tarafından insan midesinde gösterilmiş, özellikle peptik ülser hastalığı ile birlikteliği bildirilmiştir (1). H. pylori infeksiyonu dünyada oldukça yaygın olup gelişmiş ülkelerde %20-50; gelişmekte olan ülkelerde ise %50-90 oranında görülmektedir (2). H. pylori çeşitli mide hastalıklarına neden olan bir bakteri olup infeksiyon sonucunda gastrit, peptik ülser, mide mukozası ile ilişkili lenfoid doku lenfoması ve mide kanseri gelişmesi günümüzde önemini artırmaktadır (3, 4).

H. pylori infeksiyonunun tanısında, invazif ve invazif olmayan çeşitli testler kullanılmaktadır. Seroloji, üre nefes testi ve dışkıda antijen testleri invazif olmayan tanı yöntemleridir. İnvazif testler ise; hızlı üreaz testi (HÜT), histoloji, kültür ve moleküler yöntemlerdir. Bu testler için endoskopi ile alınan mide biyopsi örneğine gereksinim duyulur. Tanıda endoskopi ile alınan örneklerde, en az iki testin birlikte kullanılması, yüksek duyarlılık ve özgüllüğünden dolayı önerilmektedir (5).

H. pylori infeksiyonu tedavisinde lansoprazol ile birlikte kombine antibiyotik kullanımı gerekmektedir. Amoksisilin, klaritromisin, levofloksasin ve metronidazol, infeksiyonun tedavisinde seçilen antibakteriyel ajanlardır. Tedavi başarısızlıkları; hastanın yaşı, tedavi öncesi midedeki bakteri yükü, sigara kullanımı, hastanın ilaç uyumu ve ilaç direnci gibi nedenlere bağlanmaktadır.

Bu çalışmada, dispeptik şikayetlerle başvuran hastalardan alınan mide biyopsi örneklerinde kültür, histoloji ve HÜT yöntemleriyle H. pylori infeksiyonu varlığının araştırılması ve izolatların amoksisilin, klaritromisin, levofloksasin ve metronidazole karşı dirençlerinin antibiyotik gradyan yöntemi (Etest® bioMérieux, Marcy-l’Ètoile, Fransa) ile belirlenmesi amaçlandı.

YÖNTEMLER

Çalışmaya, alarm semptomları (kilo kaybı, bulantı, kusma, disfaji, hematemez, melena, vb.) olmayan ancak dispeptik şikayetleri olan ve gastroenteroloji bilim dalına başvurarak, endoskopik incelemeleri yapılan 278 hasta dahil edildi. Antrum ve korpus bölgelerinden alınan biyopsi örneklerinin mikrobiyolojik ve histopatolojik incelemesi yapıldı. Her hastadan histopatolojik inceleme için 2 antrum, 1 korpus; hızlı üreaz testi için 1 antrum, 1 korpus; kültür için 1 antrum, 1 korpus olmak üzere toplam 4 antrum ve 3 korpus biyopsi örneği alındı.

Eradikasyon tedavisi almış, son iki hafta içinde proton pompa inhibitörü kullanmış, son iki ay içinde antibiyotik veya bismut içeren bileşikler almış ve endoskopi için kontrendikasyon kriterlerinden birisi pozitif olan hastalar çalışma dışı bırakıldı.

Selçuk Üniversitesi Meram Tıp Fakültesi Etik Kurulu’ndan 27.02.2009 tarih ve 2009/065 karar numarasıyla onay alındı. Ayrıca, hastaların hepsine çalışma hakkında ayrıntılı bilgi verildi ve aydınlatılmış onam formu alındı.

Hızlı Üreaz Testi

Gastrik biyopsi dokusu, üre içeren bir ortamda tutulacak olursa H. pylori tarafından üretilen üreaz üreyi kısa zamanda amonyak ve bikarbonata parçalar. Amonyak üretiminin sonucu pH yükselir ve ortamdaki renk pembeye dönüşür. Bu sonuç biyopsi materyalinde bakterinin bulunduğunu gösterir (6). Çalışmamızda, biyopsi örneklerinde üreaz aktivitesini araştırmak amacıyla CLO test (Kimberly-Clark Ballard Medical Products, Roswell, GA, ABD) kullanıldı. Bir antrum örneği ve bir korpus biyopsi örneği CLO testine alındı; oda sıcaklığında bekletilen test 1 saat ve 24 saat sonra değerlendirilerek sonuçlar not edildi.

Histopatolojik İnceleme

Hastaların antrum ve korpus biyopsi preparatları, histopatolojik tanı ve organizmanın direkt taranması için sırasıyla; formalinde fiksasyon, rutin hematoksilen-eosin (HE) boyaması ve özel boyama (Giemsa boyaması) işlemlerine tabi tutularak ışık mikroskobunda birbirinden habersiz (kör) iki farklı patolog tarafından incelendi. Sonuçlar preparatlardaki bakteri yoğunluğuna göre; hafif (+), orta (++), şiddetli (+++) pozitiflik olarak raporlandı.

Bakteri Kültürü

Endoskopi ünitesinden alınan mide biyopsi örnekleri, Portagerm pylori (PORT-PYL, bioMérieux, Marcy-l’Étoile, Fransa) transport medyumu içerisinde hızlıca laboratuvara ulaştırıldıktan sonra, at serumu ilave edilmiş pylori besiyerine (PYL, bioMérieux, Marcy-l’Étoile, Fransa) ekim yapıldı. Ekimleri yapılan örnekler hemen jara (bioMérieux, Marcy-l’Étoile, Fransa) yerleştirilip H. pylori’nin üreyebileceği mikroaerofilik atmosfer (1 saat sonraki ortalama O₂ konsantrasyonu %7.5 ve 24 saat sonraki ortalama CO₂ konsantrasyonu %8) “GENbox microaer” (bioMérieux, Marcy-l’Étoile, Fransa) ile sağlanarak 37°C’de 72 saat inkübe edildi. Besiyerinde üreyen koloniler Gram boyama yapılarak incelendi. Mikroskopta, Gram negatif boyanmış, kıvrık görünümde, bazen de tipik görünümlerinin yanı sıra düz basiller görülmesi, üreaz (Urea-indole medium, bioMérieux, Marcy-l’Étoile, Fransa), katalaz (ID color Catalase, bio-Mérieux, Marcy-l’Étoile, Fransa) ve oksidaz (Oxidase Reagent, bioMérieux, Fransa) pozitifliği saptanan kolonilerin varlığında H. pylori yönünden anlamlı olarak değerlendirildi.

Antibiyotik Duyarlılık Testleri

İzolatların; amoksisilin, klaritromisin, levofloksasin ve metronidazol duyarlılığı antibiyotik gradyan yöntemiyle (Etest®, bioMérieux, Marcy-l’Ètoile, Fransa) araştırıldı. Saf olarak elde edilen H. pylori kültürlerinden alınan kolonilerle, sıvı besiyeri içinde McFarland 3 bulanıklığına göre hazırlanan bakteri süspansiyonundan, %5 koyun kanlı Mueller-Hinton besiyeri (bioMérieux, Marcy-l’Étoile, Fransa) yüzeyine ekim yapıldı. Plaklar mikroaerofilik ortamda 37 °C’de 3 ile 5 gün arasında inkübe edildi. İnkübasyon sonunda, elips şeklindeki inhibisyon zonunun Etest® şeridi ile kesiştiği noktaya karşılık gelen antibiyotik konsantrasyonu minimum inhibitör konsantrasyon (MİK) değeri olarak kabul edildi. Kontrol suşu olarak besiyerlerinin denetimi için H. pylori NCTC 11637 ve antibiyotik duyarlılık testleri için H. pylori ATCC 43504 kullanıldı. Sonuçlar Klinik ve Laboratuvar Standardları Enstitüsü (“Clinical and Laboratory Standards Institute”, CLSI) standardlarına göre değerlendirildi (7). Bu çalışmada kullanılan antibiyotiklere ait MİK değerleri Tablo 2’de gösterilmiştir.

Hastalarda altın standard olarak; tek başına kültür yöntemi ya da histoloji ve HÜT ikilisinin birlikte pozitif olması kabul edildi. Kültür, altın standard kriteri alınarak histoloji ve HÜT için duyarlılık ve özgüllük hesaplandı. Ayrıca histoloji ve HÜT’ün ikisinin birlikte pozitifliği altın standard kriteri alınarak kültür için duyarlılık ve özgüllük hesaplandı.

İstatistiksel Analiz

Verilerin istatistiksel analizi “IBM SPSS Statistics for Windows. Version 22.0” (IBM Corp., Armonk, NY, ABD)” programı kullanılarak yapıldı. p değerinin ≤ 0.05 olması istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

BULGULAR

Çalışmaya; 16-83 yaşları arasında, yaş ortalaması 40.8 olan 156 (%56.1)’sı kadın, 122 (%43.9)’si erkek 278 hasta alındı. Endoskopi işlemi sonrasında; 174 hastada gastrit ve/veya duodenit, 37 hastada duodenal ülser, 14 hastada özofajit, 35 hastada gastrik ülser, 9 hastada gastrik kanser ve 9 hastada normal endoskopik bulgular saptandı.

Tablo 1. Çalışmada H. pylori Tanısında Kullanılan Yöntemlerin Duyarlılık ve Özgüllük Değerleri

Çalışmaya alınan 278 hastanın 140’ının kültüründe üreme saptandı; 174’ünde histoloji ile pozitiflik tespit edildi. Ayrıca HÜT ile 191 hastada H. pylori pozitifliği görüldü. Altın standard kriterine göre kültür yöntemiyle 39, histoloji ile 17 ve HÜT ile 8 olguda yalancı negatif sonuç saptandı. Hastaların kültür, histoloji ve HÜT yöntemleri için duyarlılık oranları sırasıyla %76.5 ve %88.3, %87.8 ve özgüllükleri %63, %94.2 ve %57.2 olarak tespit edildi (Tablo 1).

Tablo 2. İzole edilen H. pylori Suşları (N=140) için MİK50, MİK90 Değerleri, MİK Aralıkları ve Sınır Değerleri

Kültürden izole edilen 140 H. pylori suşunda, antibiyotik gradyan yöntemiyle (Etest®) antibiyotik direnci araştırıldı. H. pylori suşlarının 9 (%6.4)’unda amoksisiline, 22 (%15.7)’sinde klaritromisine, 17 (%12.1)’sinde levofloksasine ve 57 (%40.7)’sinde metronidazole karşı direnç saptandı. İzole edilen 140 H. pylori suşu için antibiyotik gradyan yöntemiyle (Etest®) elde edilen MİK50 ve MİK90 değerleri Tablo 2’de gösterilmiştir.

TARTIŞMA

H. pylori, insan ve diğer primatların midesine yerleşen spiral şeklinde, mikroaerofilik, Gram negatif bir bakteridir. Vücuda bir defa girdiğinde, tedavi edilmediği takdirde yaşam boyu varlığını devam ettirmektedir. Ülkemiz gibi gelişmekte olan ülkelerde, H. pylori infeksiyonu, gelişmiş ülkelere göre daha sık ve daha erken yaşlarda saptanmaktadır. Çalışmamızda dispeptik şikayetleri olan hastalarda kültür ile H. pylori pozitifliği %50.3 (140/278) oranında saptandı.

H. pylori infeksiyonunun sık görülmesi ve önemli mide hastalıklarına yol açması, tanı testlerinin hızla gelişmesine neden olmuştur. Kültür, histoloji, HÜT ve moleküler testler gibi invazif; seroloji, üre nefes testi ve dışkıda antijen testleri gibi noninvazif testler tanı amacıyla kullanılmaktadır. Çalışmamızda; kültür, histoloji ve HÜT yöntemleri karşılaştırıldı. Bakterinin oksijene olan duyarlılığı, örneğin alındığı yer, taşınma koşulları ve çalışanın tecrübesi gibi nedenlerden dolayı, kültürün duyarlılığı oldukça düşüktür. Bakterinin mide mukozasında yamalı bohça biçiminde dağılım göstermesi, histoloji ve HÜT ile yalancı negatif sonuçlara yol açmaktadır. Bununla beraber oral kavitede bulunabilen ve üreaz pozitif özellik gösteren diğer bakterilerden veya HÜT’ün 24 saatten sonra değerlendirilmesinden dolayı yalancı pozitif sonuçlar görülebilmektedir (8, 9).  H. pylori’nin saptanmasının yanı sıra antibiyotik direncini de gösterebilen moleküler yöntemler duyarlılığı ve özgüllüğü yüksek diğer invazif testlerdir. Bu testler, özel transport şartları gerektirmeyen, düşük sayıdaki bakteriyi tespit edebilen ve hızlı sonuç alınan tanı yöntemleridir.

Yapılan araştırmalarda, endoskopi ve biyopsi gerektiren invazif testlerde, mide antrum ve korpus örneklerinin birlikte incelenmesinin tanının doğruluğunu artırdığı bildirilmektedir (10).  Çalışmamızda endoskopi sırasında tüm hastalardan hem antrumdan hem de korpustan biyopsi örneği alındı.

Weiss ve arkadaşları (11) çalışmalarında, kültür ve HÜT duyarlılığı sonuçlarını sırasıyla %70 ve %88 olarak tespit etmiştir. Khalifehgholi ve arkadaşları (12), 91 hasta üzerinde yaptıkları çalışmada, duyarlılık ve özgüllükleri; histolojide %9.6, %77.8 ve HÜT’te %95.6, %100 olarak tespit etmiştir. Ankara’da 2016 yılında 126 hasta üzerinde yapılan bir çalışmada, duyarlılık ve özgüllükler; kültürde %68.1 ve %100; histolojide %94.8 ve %100; HÜT’te %87.9 ve %70 saptanmıştır (13). Ülkemizde 102 çocuk hasta üzerinde yapılan başka bir araştırmada kültürün duyarlılığı %54.9, HÜT’ün duyarlılığı %89.2 olarak bildirilmiştir (14). Kaklıkkaya ve arkadaşlarının (15), 200 antral mide biyopsi örneğinde yaptıkları çalışmada, duyarlılık ve özgüllükler; kültürde %87.1, %99 ve HÜT’te %77.2, %92 olarak saptanmıştır. Çalışmamızda altın standard kriterine göre 278 mide biyopsi örneği değerlendirildiğinde duyarlılık ve özgüllükler; kültürde %76.5 ve %88; histolojide %87,8 ve %63; HÜT’te %94.2 ve %57.2 olarak tespit edilmiştir.

Tedavi başarısızlığının büyük bir kısmı, kullanılan antibiyotiklere karşı direnç nedeniyle ortaya çıkmaktadır (16, 17). Dilüsyon yöntemlerine göre daha kısa zamanda ve kolay uygulanabilir bir yöntem olan antibiyotik gradyan yöntemi (Etest®) antibiyotik duyarlılık araştırmalarında sıklıkla kullanılmaktadır. 2007 yılında Tayvan’da yapılan bir çalışmada amoksisilin direnci %36.1 oranında görülmüştür (18). Ülkemizde son yıllarda yapılan bir çalışmada amoksisilin direnci %3.2 olarak saptanmıştır (19). Çalışmamızda antibiyotik gradyan yöntemiyle (Etest®) %6.4 oranında amoksisilin direnci saptandı. Kanada, İran, Peru ve Türkiye’de yapılan araştırmalarda, klaritromisin direnç oranları, sırasıyla %40, %21.7, %35.5 ve %28 olarak görülmüştür (20-23). Çalışmamızda ise %15.7 oranında klaritromisin direnci tespit edildi.

Amerika’da yapılan bir çalışmada levofloksasin direnci %31.3 olarak görülmüştür (24). Kanada’da 2015 yılında 20 H. pylori izolatında yapılan bir çalışmada levofloksasin direnci %30 olarak saptanmıştır (20). Ülkemizde 2015 yılında yapılan bir çalışmada levofloksasin direnci %29.5 olarak saptanmıştır (25). Çalışmamızda antibiyotik gradyan yöntemiyle (Etest®) %12.1 oranında levofloksasin direnci saptandı. Ülkemizde bölgeler arasında farklılıklar olmakla birlikte H. pylori’de metronidazol direnci %41.9-53 arasında değişmektedir (19, 26). Çalışmamızda antibiyotik gradyan yöntemiyle (Etest®) metronidazol direnci %40.7 oranında saptandı.

Sonuç olarak, çalışmamızda kültür, HÜT ve histoloji yöntemleri arasında en duyarlı testin HÜT olduğu tespit edildi. Ancak özgüllüğü düşük bulunduğu için sonuçların en az bir farklı yöntemle desteklenmesi gerekmektedir. Kültür yönteminin özgüllüğünü yüksek olarak tespit etmemize rağmen, duyarlılığı diğer yöntemlere göre oldukça düşük olarak görüldü. H. pylori kültürünün duyarlılığının düşük olması; bakterinin nazlı, güç üreyen bir mikroorganizma olması, klinik örneğin alınması ve transport koşullarının izolasyon şansını doğrudan etkilemesi gibi faktörlerden kaynaklanabilir. Gelişen teknolojilerle birlikte; kültür, histoloji ve HÜT yöntemlerini, bir diğer altın standard olabilecek moleküler yöntemlerle birlikte inceleyen araştırmalara ihtiyaç bulunmaktadır.